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制片技术

常规病理HE制片技术疑难解答及注意事项

一、常规病理HE制片疑难解答

  1、为何组织脱水处理要从低浓度开始?

  答:乙醇是无色、透明、易燃及亲水性的液体,易混合于其他有机溶液,脱水快速可靠,各级浓度乙醇均可用于脱水。如果用乙醇进行脱水处理,起始浓度最好为70%乙醇水溶液,随后是95%乙醇和100%无水乙醇。对特别易破碎的组织标本,推荐脱水处理时使用的乙醇起始浓度为30%乙醇。高浓度乙醇脱水,易于在组织外围形成硬化,俗称“极化”,阻碍固定液的渗透,影响组织的正常脱水。故组织脱水正确的做法是从低浓度乙醇开始,循序渐进。特殊需要除外。

  2、如何防治或减少组织切片空洞?

  答:此种情况,不仅影响切片的美观,更主要的是易给病理医生的诊断造成遗漏。如果随着蜡带连续深切,空洞越变越小,说明切片中的空洞是没有切全而造成的人为改变。当切蜡块用的力太大太猛时,组织中的小斑点、小斑块会从蜡块中脱落,在切片上留下一个个的小空洞。这种情况在脱水、透明或浸蜡处理过度的组织中极易发生。比如,肝、脾、肾、脑、淋巴结以及子宫类的标本,若取材太薄,易造成处理过度,蜡块在粗修和切片时经常会出现空洞。所以,取材时标本的厚度要适中,不能太薄。切片时如果遇到此类蜡块,可将蜡块在冰盘冷却片刻或用湿的棉花沾一下,蜡块接触刀刃用力不能太猛太重,以减少这一人为现象的出现。如果发现蜡带上的组织切片出现空洞,只要蜡块中的组织充足,应尽量再缓慢切片,直到空洞消失。另外,空洞也可能是因为组织在浸蜡时,蜡液中有残留的空气存在所致。这种情况在肺组织标本中尤为多见。即使连续切片空洞也不容易消失。

  3、影响组织切片展片的因素有哪些?

  答:1)石蜡的性质,如蜡的硬度、蜡的熔点以及蜡的添加剂,特别是其内某些带有硬化性质的添加剂。2)切片的厚薄。3)展片的水温。对于绝大多数石蜡,漂烘仪的温度一般定在40℃~44℃,如果温度高于45℃,切片的皱褶会很快消失,并且石蜡会溶解。4)对于某些易于出现邹折的切片,可以二次展片。具体做法是,先将组织切片放在带有30%乙醇的玻璃平板上,然后轻轻推入漂片仪中。或者,先将组织切片放在盛有冷水的容器中,然后再用载波片裱起,轻轻移至漂片仪中。再者,将组织切片垂直立起,让底边先接触漂片仪水面,然后用镊子向右外方向轻轻推展,将组织切片光亮面平稳轻触水面。如此可减少切片在水面因牵拉和掼压展片时出现气泡。

  4、组织切片出现染色白点的原因?

  答:切片在脱蜡步骤完成以后,出现大片白色的斑点。如果这些斑点没有被发现或是被及时祛除,染色后镜下则会呈现出不规则的染色或染色不均匀的改变。原因是由于烤(烘)片温度太低,玻片在脱蜡前没有充分烤(烘)干;切片在二甲苯停留时间不足,或二甲苯使用过久,造成脱蜡不尽。处理对策:如果玻片是由于没有烤(烘),先用无水乙醇处理去除玻片上的水分,然后重新用二甲苯脱去石蜡。如果烤(烘)干不足的现象比较严重,可能导致切片脱落,则无法补救。如果白色斑点是由于切片在二甲苯停留时间不足造成,或使用的二甲苯过久,切片则需退回到二甲苯停留时间相对长些,或更换二甲苯,脱色、漂白、重新染色。

  5、如何理解组织脱水过度的概念?

  答:现在的技术人员越来越清楚地认识到,组织脱水过度并不是正真的过度。因为有人用反复实验表明,脱水时间长的组织反而利于切片,如尸检标本。所以说,这里的过度其实不是因组织真的脱水过度而过度,而是可能因为组织要么固定不佳,要么脱水不足,导致组织内部含有一定水分,在遇到二甲苯透明,石蜡浸透时,在温度的作用下引起的硬化而已。

  6、组织蜡块放冰箱冷冻好还是放冷水浸泡好?

  答:组织块的最适宜温度不是一成不变的。把组织块放冰箱冷冻或用冰块冷却组织有助于切较硬的组织,因为这样做可以使组织和蜡块之间保持均匀一致的硬度。如果将组织放入冷水中,则可以使硬度均匀降低,还可以适当增加组织块的湿度。用喷雾冷却剂来冷却组织块的表面,效果并不理想。如果必须要使用,那么尽量只喷洒极少量,以防止组织块表面结冰或者整个组织块开裂。

  7、用于包裹小组织的纸如何选择?

  答:尽量选质地优良的擦镜纸或茶叶袋包装纸,少选质地差纤维多的纸张或纱布,放置粘连到小组织上影响切片质量。另外,纸包不要太公正,以免浸蜡后包埋时,技术人员因找不到纸角难以打开纸包。包裹小组织标本时用“包混沌”方法最好,易于开包。

  8、组织切片出现“梯田”样改变的原因?

  答:“梯田”实际是指组织切片出现的波纹状改变。此类情况,大多数是因为蜡块没有被夹紧或刀片在切片机上没有被拧紧的缘故。除此之外,可能还有其他其它原因,比如切片机老化机械部分松动等。另外,波纹还可能是由于刀的倾斜度过大。波纹现象经常出现在质地坚硬的组织蜡块,如子宫肌瘤等。肉眼可见的波纹状震颤在漂片水槽就能看见。对于坚硬或坚韧的组织蜡块,可采用蜡块表面用5N盐酸软化处理的办法,改善切片质量。方法如下:

  (1)将切片中出现列裂隙的组织蜡块面朝下,置入带有5 N 盐酸的玻璃容器或塑料容器内,浸泡5min~10min,取出后用干纱布擦去蜡块表面的盐酸。

  (2)蜡块不须冷冻,在室温(25℃)下直接在切片机切片,切片厚度4μm。

  (3)裱片时,先将切片光面朝下放入冷水中,然后,再用干净的载玻片将其移入漂片仪的水槽内,温度约45℃~47℃;略展片刻,待切片充分展平后,迅速裱贴在载玻片上。

  (4)常规烘/烤切片、染色、封固。振颤或微小振动大多数是缘自于组织处理时过度脱水所致。但是也可能是因为刀钝,角度太大,或者切片速度太快。如果组织的确是由于脱水过度造成的,可用湿纱布或棉花沾些许温水檫拭蜡块表面,将会有助于缓解这一现象。比如,淋巴结组织本身就缺少水分,如果取材时切的太薄,组织一经脱水处理,就会造成处理过度、质地坚硬,切片时产生振颤或微小振动,破坏淋巴结的完整结构,让病理医生难以做出正确病理诊断而耽误病人。

  9、包埋后的组织出现脱钙不全时的补救方法?

  答:方法如下:

(1)将切片中出现列裂隙的组织蜡块面朝下,置入带有5 N 盐酸的玻璃容器或塑料容器内,浸泡5min~10min,取出后用干纱布擦去蜡块表面的盐酸。

(2)蜡块不须冷冻,在室温(25℃)下直接在切片机切片,切片厚度4μm。

(3)裱片时,先将切片光面朝下放入冷水中,然后,再用干净的载玻片将其移入漂片仪的水槽内,温度约45℃~47℃;略展片刻,待切片充分展平后,迅速裱贴在载玻片上。

(4)常规烘/烤切片、染色、封固。

  二、操作过程中的注意事项

  1、组织包埋时注意“二次加蜡”

  包埋操作时具体的注意事项:先取大小合适的不锈钢模型,注入蜡液置于热台上,液面刚好与模型的上缘平齐,不得低于或高于此限。取出包埋盒内的组织,校对正确后用干净的热镊子将所有组织悉数放入模型的底部,待组织与模型内的蜡液充分融合后,按要求排列后迅速移动模型至冷台,至底部石蜡刚开始凝固,用镊子轻压组织数秒,待组织埋平后,迅速盖上包埋盒注上蜡液,约过10 s~15 s,包埋盒与模型周边的蜡液凝固后,再次补充注入少许蜡液,即进行“二次加蜡”,以增加包埋盒的稳固性,防止切片时因包埋盒松动引起切片震颤。注意液面高度不得高于包埋盒上缘,加盖包埋盒时一定要保持其与模型底部平面平行,无前后左右倾斜的现象。用塑料包埋盒包埋组织时,应注意待包埋模型底部石蜡开始凝固后,盖上包埋盒,待其四周凝固后,进行“二次加蜡”。这样做的目的是使得包埋盒与组织蜡块接触更加稳固,减少和防止切片时产生振颤或包埋盒与组织蜡块脱落。另外,还需注意的是二次加蜡不能过满,否则蜡块不能与切片机夹具完全吻合,造成切片时松动震颤,影响切片质量。

  2、组织切片时注意“粗修”

  首先,把切片工作程序分为两步:预备切片和正式切片,即粗修和细切。其次,每天切片之前应先检查切片机的角度并将其调整固定,即刀座的角度约在10°,夹具的上下二边与刀刃平行,左右二边与刀刃垂直。预备切片和正式切片过程中所有角度均保持一致不得随意变动。

  预备切片:应用轮转式切片机(附二档进样装置)装上旧的一次性刀片操作,将蜡块表面多余的石蜡及不平整的组织修去,至组织尽量暴露最大面,用毛刷刷净,重新冷冻以备正式切片。遇有钙化或硬化组织可用5N盐酸对蜡块表面进行软化处理。

  正式切片:用毛刷将切片机打扫干净,换上新的一次性刀片准备切片。切片厚度通常规定为4μm,切片的完整性平整性要求组织完整,厚薄均匀,平整无皱,无刀痕。选取平整光滑无污染的切片置入水面,用纱布将载玻片擦拭干净,捞取切片时使切片与载玻片沿长轴方向平行。漂片仪的温水须每日更换,保持清洁,温度范围在45℃~49℃之间。在载玻片上写上正确的号码后迅速放入烘片箱内,烘片箱温度设置为80℃~90℃左右。通常烘烤15min~30min即可染色。

  3、切片工具的选择,镊子和毛刷

  镊子建议推荐使用口腔科使用的牙科20CM长弯镊,利于切片展片的操作,眼科弯镊太小,操作灵活性低于前者。毛刷建议推荐使用油画笔、水粉笔,普通毛笔松散,容易刺破组织切片,不利于操作。

  4、切片粗修时手轮的操作

  建议推荐手轮全转,而不是手轮上下半转。手轮上下半转时蜡块不小心容易“啃刀”

  5、切片时安全性的操作

  切片机一般都配备手轮锁,可以将手轮锁定于任何位置,防止机器闲置期间意外触及手轮,导致人员意外伤害或夹头撞击刀具。更人性化的切片机往往还配备第二手轮锁,手轮把手只能被锁定于最高点,便于在切片过程中随时更换样品或刀具。

  无论钢刀架还是一次性刀片架,都应该配有牢固的护刀器,在更换样品或机器闲置的时候技术操作人员一定要养成良好习惯,将护刀器覆盖在刀刃上方,对人员和刀具都是一种保护。好的护刀器必须能安全地覆盖刀刃的全长。

  6、切片现场一次性刀片等锐器的存放

  安全是基于良好的组织,在一个干净整洁的实验室,是很少有机会发生事故的。标本处理完毕后,应及时消毒工作台面和取材器械。一次性刀片用完后,玻璃制品一旦破损等等,应废弃在标有“锐器”字样的容器内。

  7、捞片和提片

  捞片的动作是用载玻片将组织切片托起的感觉,容易在玻片上残留多量水份。提片的动作是将载玻片向前上方提拉,将组织切片裱起,这个方法玻片上水份残留很少。

  8、烤片和烘片

  组织切片放在热台受热上,谓之烤片;带有热源的空间受热,谓之烘片。烤片要求组织切片裱起后先倒置将水份沥干,等组织微微发白后,再放置热台烤片,5-10 min。此法要求组织切片不能带有水份,防治组织切片因带有的水份受热后扩散导致组织散片。烘片时只要将组织切片裱起后,即可竖立插入染色架后置入箱内受热。水份的影响不是太大。

切片机  http://www.taiva.com.cn/index.php?c=category&id=32

脱水机 http://www.taiva.com.cn/index.php?c=category&id=35

包埋机  http://www.taiva.com.cn/index.php?c=category&id=30

染色机 http://www.taiva.com.cn/index.php?c=category&id=33

时  间:2021-07-26 17:24

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