常规病理HE制片技术疑难解答及注意事项

一、常规病理HE制片疑难解答

　　1、为何组织脱水处理要从低浓度开始?

　　答：乙醇是无色、透明、易燃及亲水性的液体，易混合于其他有机溶液，脱水快速可靠，各级浓度乙醇均可用于脱水。如果用乙醇进行脱水处理，起始浓度最好为70%乙醇水溶液，随后是95%乙醇和100%无水乙醇。对特别易破碎的组织标本，推荐脱水处理时使用的乙醇起始浓度为30%乙醇。高浓度乙醇脱水，易于在组织外围形成硬化，俗称“极化”，阻碍固定液的渗透，影响组织的正常脱水。故组织脱水正确的做法是从低浓度乙醇开始，循序渐进。特殊需要除外。

　　2、如何防治或减少组织切片空洞?

　　答：此种情况，不仅影响切片的美观，更主要的是易给病理医生的诊断造成遗漏。如果随着蜡带连续深切，空洞越变越小，说明切片中的空洞是没有切全而造成的人为改变。当切蜡块用的力太大太猛时，组织中的小斑点、小斑块会从蜡块中脱落，在切片上留下一个个的小空洞。这种情况在脱水、透明或浸蜡处理过度的组织中极易发生。比如，肝、脾、肾、脑、淋巴结以及子宫类的标本，若取材太薄，易造成处理过度，蜡块在粗修和切片时经常会出现空洞。所以，取材时标本的厚度要适中，不能太薄。切片时如果遇到此类蜡块，可将蜡块在冰盘冷却片刻或用湿的棉花沾一下，蜡块接触刀刃用力不能太猛太重，以减少这一人为现象的出现。如果发现蜡带上的组织切片出现空洞，只要蜡块中的组织充足，应尽量再缓慢切片，直到空洞消失。另外，空洞也可能是因为组织在浸蜡时，蜡液中有残留的空气存在所致。这种情况在肺组织标本中尤为多见。即使连续切片空洞也不容易消失。

　　3、影响组织切片展片的因素有哪些?

　　答：1)石蜡的性质，如蜡的硬度、蜡的熔点以及蜡的添加剂，特别是其内某些带有硬化性质的添加剂。2)切片的厚薄。3)展片的水温。对于绝大多数石蜡，漂烘仪的温度一般定在40℃~44℃，如果温度高于45℃，切片的皱褶会很快消失，并且石蜡会溶解。4)对于某些易于出现邹折的切片，可以二次展片。具体做法是，先将组织切片放在带有30%乙醇的玻璃平板上，然后轻轻推入漂片仪中。或者，先将组织切片放在盛有冷水的容器中，然后再用载波片裱起，轻轻移至漂片仪中。再者，将组织切片垂直立起，让底边先接触漂片仪水面，然后用镊子向右外方向轻轻推展，将组织切片光亮面平稳轻触水面。如此可减少切片在水面因牵拉和掼压展片时出现气泡。

　　4、组织切片出现染色白点的原因?

　　答：切片在脱蜡步骤完成以后，出现大片白色的斑点。如果这些斑点没有被发现或是被及时祛除，染色后镜下则会呈现出不规则的染色或染色不均匀的改变。原因是由于烤(烘)片温度太低，玻片在脱蜡前没有充分烤(烘)干;切片在二甲苯停留时间不足，或二甲苯使用过久，造成脱蜡不尽。处理对策：如果玻片是由于没有烤(烘)，先用无水乙醇处理去除玻片上的水分，然后重新用二甲苯脱去石蜡。如果烤(烘)干不足的现象比较严重，可能导致切片脱落，则无法补救。如果白色斑点是由于切片在二甲苯停留时间不足造成，或使用的二甲苯过久，切片则需退回到二甲苯停留时间相对长些，或更换二甲苯，脱色、漂白、重新染色。

　　5、如何理解组织脱水过度的概念?

　　答：现在的技术人员越来越清楚地认识到，组织脱水过度并不是正真的过度。因为有人用反复实验表明，脱水时间长的组织反而利于切片，如尸检标本。所以说，这里的过度其实不是因组织真的脱水过度而过度，而是可能因为组织要么固定不佳，要么脱水不足，导致组织内部含有一定水分，在遇到二甲苯透明，石蜡浸透时，在温度的作用下引起的硬化而已。

　　6、组织蜡块放冰箱冷冻好还是放冷水浸泡好?

　　答：组织块的最适宜温度不是一成不变的。把组织块放冰箱冷冻或用冰块冷却组织有助于切较硬的组织，因为这样做可以使组织和蜡块之间保持均匀一致的硬度。如果将组织放入冷水中，则可以使硬度均匀降低，还可以适当增加组织块的湿度。用喷雾冷却剂来冷却组织块的表面，效果并不理想。如果必须要使用，那么尽量只喷洒极少量，以防止组织块表面结冰或者整个组织块开裂。

　　7、用于包裹小组织的纸如何选择?

　　答：尽量选质地优良的擦镜纸或茶叶袋包装纸，少选质地差纤维多的纸张或纱布，放置粘连到小组织上影响切片质量。另外，纸包不要太公正，以免浸蜡后包埋时，技术人员因找不到纸角难以打开纸包。包裹小组织标本时用“包混沌”方法最好，易于开包。

　　8、组织切片出现“梯田”样改变的原因?

　　答：“梯田”实际是指组织切片出现的波纹状改变。此类情况，大多数是因为蜡块没有被夹紧或刀片在切片机上没有被拧紧的缘故。除此之外，可能还有其他其它原因，比如切片机老化机械部分松动等。另外，波纹还可能是由于刀的倾斜度过大。波纹现象经常出现在质地坚硬的组织蜡块，如子宫肌瘤等。肉眼可见的波纹状震颤在漂片水槽就能看见。对于坚硬或坚韧的组织蜡块，可采用蜡块表面用5N盐酸软化处理的办法，改善切片质量。方法如下：

　　(1)将切片中出现列裂隙的组织蜡块面朝下，置入带有5 N 盐酸的玻璃容器或塑料容器内，浸泡5min～10min，取出后用干纱布擦去蜡块表面的盐酸。

　　(2)蜡块不须冷冻，在室温(25℃)下直接在切片机切片，切片厚度4μm。

　　(3)裱片时，先将切片光面朝下放入冷水中，然后，再用干净的载玻片将其移入漂片仪的水槽内，温度约45℃～47℃;略展片刻，待切片充分展平后，迅速裱贴在载玻片上。

　　(4)常规烘/烤切片、染色、封固。振颤或微小振动大多数是缘自于组织处理时过度脱水所致。但是也可能是因为刀钝，角度太大，或者切片速度太快。如果组织的确是由于脱水过度造成的，可用湿纱布或棉花沾些许温水檫拭蜡块表面，将会有助于缓解这一现象。比如，淋巴结组织本身就缺少水分，如果取材时切的太薄，组织一经脱水处理，就会造成处理过度、质地坚硬，切片时产生振颤或微小振动，破坏淋巴结的完整结构，让病理医生难以做出正确病理诊断而耽误病人。

　　9、包埋后的组织出现脱钙不全时的补救方法?

　　答：方法如下：

(1)将切片中出现列裂隙的组织蜡块面朝下，置入带有5 N 盐酸的玻璃容器或塑料容器内，浸泡5min～10min，取出后用干纱布擦去蜡块表面的盐酸。

(2)蜡块不须冷冻，在室温(25℃)下直接在切片机切片，切片厚度4μm。

(3)裱片时，先将切片光面朝下放入冷水中，然后，再用干净的载玻片将其移入漂片仪的水槽内，温度约45℃～47℃;略展片刻，待切片充分展平后，迅速裱贴在载玻片上。

(4)常规烘/烤切片、染色、封固。

　　二、操作过程中的注意事项

　　1、组织包埋时注意“二次加蜡”

　　包埋操作时具体的注意事项：先取大小合适的不锈钢模型，注入蜡液置于热台上，液面刚好与模型的上缘平齐，不得低于或高于此限。取出包埋盒内的组织，校对正确后用干净的热镊子将所有组织悉数放入模型的底部，待组织与模型内的蜡液充分融合后，按要求排列后迅速移动模型至冷台，至底部石蜡刚开始凝固，用镊子轻压组织数秒，待组织埋平后，迅速盖上包埋盒注上蜡液，约过10 s～15 s，包埋盒与模型周边的蜡液凝固后，再次补充注入少许蜡液，即进行“二次加蜡”，以增加包埋盒的稳固性，防止切片时因包埋盒松动引起切片震颤。注意液面高度不得高于包埋盒上缘，加盖包埋盒时一定要保持其与模型底部平面平行，无前后左右倾斜的现象。用塑料包埋盒包埋组织时，应注意待包埋模型底部石蜡开始凝固后，盖上包埋盒，待其四周凝固后，进行“二次加蜡”。这样做的目的是使得包埋盒与组织蜡块接触更加稳固，减少和防止切片时产生振颤或包埋盒与组织蜡块脱落。另外，还需注意的是二次加蜡不能过满，否则蜡块不能与切片机夹具完全吻合，造成切片时松动震颤，影响切片质量。

　　2、组织切片时注意“粗修”

　　首先，把切片工作程序分为两步：预备切片和正式切片，即粗修和细切。其次，每天切片之前应先检查切片机的角度并将其调整固定，即刀座的角度约在10°，夹具的上下二边与刀刃平行，左右二边与刀刃垂直。预备切片和正式切片过程中所有角度均保持一致不得随意变动。

　　预备切片：应用轮转式切片机(附二档进样装置)装上旧的一次性刀片操作，将蜡块表面多余的石蜡及不平整的组织修去，至组织尽量暴露最大面，用毛刷刷净，重新冷冻以备正式切片。遇有钙化或硬化组织可用5N盐酸对蜡块表面进行软化处理。

　　正式切片：用毛刷将切片机打扫干净，换上新的一次性刀片准备切片。切片厚度通常规定为4μm，切片的完整性平整性要求组织完整，厚薄均匀，平整无皱，无刀痕。选取平整光滑无污染的切片置入水面，用纱布将载玻片擦拭干净，捞取切片时使切片与载玻片沿长轴方向平行。漂片仪的温水须每日更换，保持清洁，温度范围在45℃～49℃之间。在载玻片上写上正确的号码后迅速放入烘片箱内，烘片箱温度设置为80℃～90℃左右。通常烘烤15min～30min即可染色。

　　3、切片工具的选择，镊子和毛刷

　　镊子建议推荐使用口腔科使用的牙科20CM长弯镊，利于切片展片的操作，眼科弯镊太小，操作灵活性低于前者。毛刷建议推荐使用油画笔、水粉笔，普通毛笔松散，容易刺破组织切片，不利于操作。

　　4、切片粗修时手轮的操作

　　建议推荐手轮全转，而不是手轮上下半转。手轮上下半转时蜡块不小心容易“啃刀”

　　5、切片时安全性的操作

　　切片机一般都配备手轮锁，可以将手轮锁定于任何位置，防止机器闲置期间意外触及手轮，导致人员意外伤害或夹头撞击刀具。更人性化的切片机往往还配备第二手轮锁，手轮把手只能被锁定于最高点，便于在切片过程中随时更换样品或刀具。

　　无论钢刀架还是一次性刀片架，都应该配有牢固的护刀器，在更换样品或机器闲置的时候技术操作人员一定要养成良好习惯，将护刀器覆盖在刀刃上方，对人员和刀具都是一种保护。好的护刀器必须能安全地覆盖刀刃的全长。

　　6、切片现场一次性刀片等锐器的存放

　　安全是基于良好的组织，在一个干净整洁的实验室，是很少有机会发生事故的。标本处理完毕后，应及时消毒工作台面和取材器械。一次性刀片用完后，玻璃制品一旦破损等等，应废弃在标有“锐器”字样的容器内。

　　7、捞片和提片

　　捞片的动作是用载玻片将组织切片托起的感觉，容易在玻片上残留多量水份。提片的动作是将载玻片向前上方提拉，将组织切片裱起，这个方法玻片上水份残留很少。

　　8、烤片和烘片

　　组织切片放在热台受热上，谓之烤片;带有热源的空间受热，谓之烘片。烤片要求组织切片裱起后先倒置将水份沥干，等组织微微发白后，再放置热台烤片，5-10 min。此法要求组织切片不能带有水份，防治组织切片因带有的水份受热后扩散导致组织散片。烘片时只要将组织切片裱起后，即可竖立插入染色架后置入箱内受热。水份的影响不是太大。

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